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【目的】 比較慢速冷凍、麥管玻璃化冷凍和尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍對(duì)人類卵巢組織中卵泡形態(tài)的影響。【方法】 16例人卵巢組織切成薄片隨機(jī)分配到新鮮卵巢組(A組)、麥管玻璃化冷凍組（B組）、尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍組（C組）和慢速冷凍組（D組）后行組織學(xué)和電鏡檢查。【結(jié)果】 A、B、C、D組中形態(tài)正常的原始卵泡比例分別為72.5%±8.4%、65.6%±12.8%、 66.1%±11.1%、48.4%±13.3%；形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例分別為62.0%±13.9%、58.1%±7.9%、59.0%±16.2%、37.0%±14.0%。D組中形態(tài)正常的原始卵泡比例和初級(jí)卵泡比例均明顯低于A、B、C組。B、C組形態(tài)正常的原始卵泡比例和初級(jí)卵泡比例，與A組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B、C組中形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，D組中形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)存在一定程度的改變。【結(jié)論】 玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法。
【關(guān)鍵詞】 卵巢組織; 慢速冷凍; 玻璃化冷凍； 卵泡
Abstract:【Objective】 To compare the effect of slow cooling with vitrification to get a more effective procedure for human ovarian tissue cryopreservation.【Methods】 Ovarian biopsies from 16 patients were cut into ovarian pieces (OPs) of 1mm thickness which randomly distributed into fresh OPs (Group A), conventional-straw vitrificated OPs (Group B), vitrificated OPs using nylon mesh (Group C) and slow cooled OPs (Group D) treatment Groups. Histological and ultrastructural observation of OPs was performed after cryopreservation.【Results】 The proportions of morphologically normal primordial and primary follicles from Group A, Group B, Group C, and Group D were 72.5%±8.4% and 62.0%±13.9%, 65.6%±12.8% and 58.1%±7.9%, 66.1%±11.1% and 59.0%±16.2%, 48.4%±13.3% and 37.0%±14.0%, respectively. The proportions of morphologically normal primordial and primary follicles from Group D were lower than those from Group A, Group B, and Group C. The difference in proportions of morphologically normal primordial follicles among Group A, Group B, and Group C was not significant, so were the proportions of morphologically normal primary follicles. The ultrastructural studies showed that in primordial follicles considered normal at histological analysis, there are no difference among Group A, Group B, and Group C. While there were a few abnormalities in Group D.【Conclusion】 Vitrification is more favorable than slow cooling in human ovarian cryopreservation.
Key words: ovarian tissue; slow freezing; vitrification； follicle
隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的飛速發(fā)展，惡性腫瘤患者的生存率得到明顯提高，但是抗癌治療對(duì)卵巢功能存在一定程度的損傷，出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕和卵巢功能早衰等，對(duì)患者的生存質(zhì)量和生育能力造成嚴(yán)重影響。因此，如何保存患者的卵巢功能成為迫切需要解決的問(wèn)題。卵巢組織冷凍保存是一種較理想的卵巢功能保存方法。目前常用的冷凍方法是慢速冷凍。但是慢速冷凍難以*避免冰晶形成，而且需要借助精密控溫儀器，操作較復(fù)雜，從而影響慢速冷凍在卵巢組織冷凍保存中的推廣應(yīng)用。玻璃化冷凍，是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的冷凍方法，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需精密儀器控溫［1,2］。玻璃化冷凍的關(guān)鍵是使組織細(xì)胞較好的形成“玻璃化"態(tài)，盡量減少冰晶的形成。目前主要是通過(guò)改良冷凍載物加快冷凍降溫速度來(lái)改善玻璃化冷凍效果。本研究比較慢速冷凍、尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對(duì)人類卵巢組織中卵泡形態(tài)的影響，探討人類卵巢組織適宜的冷凍保存方法，為凍融卵巢組織在移植、體外培養(yǎng)等研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 標(biāo)本來(lái)源
選取中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科2004年6月至2005年2月間進(jìn)行卵巢手術(shù)的患者16例為研究對(duì)象，年齡27～35（30.2±2.5）歲，有規(guī)律月經(jīng)、無(wú)內(nèi)分泌紊亂、無(wú)放化療史且半年內(nèi)無(wú)激素服用史。卵巢組織冷凍保存通過(guò)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，與患者簽署知情同意書。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
①在開腹或腹腔鏡手術(shù)中活檢外觀正常的卵巢組織，在室溫保存的磷酸鹽緩沖液中迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。將卵巢皮質(zhì)剪成約5 mm×2 mm×1 mm的組織片，隨機(jī)分配到新鮮卵巢組（A組）、麥管玻璃化冷凍組（B組）、尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍組（C組）和慢速冷凍組（D組）。②B組：卵巢組織片浸泡在快速冷凍液中（含有5.5 mol/L乙二醇、1.0 mol/L 蔗糖、100 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），在室溫下平衡10 min用麥管（0.25 mL）按3段式法裝管，炭粉封口后直接投入液氮中。保存48 h后采用3步法依次在含有1.0 mol/L蔗糖和100 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液、0.5 mol/L蔗糖和50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液、0.25 mol/L蔗糖和25 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中逐步稀釋去除冷凍保護(hù)劑，每次平衡時(shí)間5 min，zui后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次。③C組：卵巢組織片在快速冷凍液中室溫下平衡10 min，將卵巢組織片平鋪放入尼龍網(wǎng)袋（長(zhǎng)2 cm、寬2 cm、網(wǎng)孔直徑80 μm），將尼龍網(wǎng)袋直接投入液氮中。保存48 h后進(jìn)行快速?gòu)?fù)溫，復(fù)溫方法同B組。④D組：卵巢組織片浸泡在慢速冷凍液中（含有1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），在0 ℃平衡30 min，裝管方法同B組，采用Oktay[3]的慢速冷凍方法保存。將麥管放入程序冷凍儀內(nèi)，從0 ℃開始以2 ℃/min的速度降溫至-7 ℃，平衡10 min后進(jìn)行人工植冰，再以0.3 ℃/min的速度緩慢降溫至-40 ℃，后以10 ℃/min的速度降溫至-140 ℃，zui后將麥管投入液氮中，保存48 h后進(jìn)行快速?gòu)?fù)溫，以冷凍保護(hù)劑的濃度梯度逐步置換冷凍保護(hù)劑（含有1.0 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，含有0.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，含有0.25 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖、50 mL/L胎牛血清的磷酸鹽緩沖液），每次平衡時(shí)間5 min，zui后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次。
1.3 組織學(xué)檢查
石蠟包埋卵巢組織，以5 μm的厚度連續(xù)切片，間隔50 μm的厚度行HE染色在光鏡下閱片。單盲法觀察原始卵泡和初級(jí)卵泡的形態(tài)。按Gougeon[2]的標(biāo)準(zhǔn)觀察卵泡形態(tài)：正常的卵泡結(jié)構(gòu)為卵泡和卵母細(xì)胞均呈圓形，卵母細(xì)胞核無(wú)固縮，顆粒細(xì)胞分布均勻，基底膜完整；異常的卵泡結(jié)構(gòu)為卵泡結(jié)構(gòu)不完整或消失，卵母細(xì)胞皺縮，卵母細(xì)胞核固縮，顆粒細(xì)胞排列紊亂。原始卵泡和初級(jí)卵泡計(jì)數(shù)以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記，計(jì)算出每個(gè)卵巢組織片中形態(tài)正常的原始卵泡比例和初級(jí)卵泡比例。其他發(fā)育階段的卵泡數(shù)目極少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
1.4 電鏡檢查
A、B、C、D 4組中每組各選2個(gè)卵巢組織片固定在25 g/L戊二醛中，經(jīng)包埋修塊后行半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色后在光鏡下定位組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡，超薄切片后經(jīng)醋酸鈾及*雙重染色后在透視電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組中形態(tài)正常的卵泡比例采用One-Way ANOVA分析，各組之間兩兩比較用LSD方法，P< 0.05認(rèn)為差異有顯著性。
2 結(jié) 果
2.1 組織學(xué)檢查
A組共觀察到原始卵泡196個(gè)，形態(tài)正常的原始卵泡比例為72.5％±8.4％，初級(jí)卵泡41個(gè)，形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例為62.0％±13.9％；B組共觀察到原始卵泡233個(gè)，形態(tài)正常的原始卵泡比例為65.6％±12.8％，初級(jí)卵泡48個(gè)，形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例為58.1％±7.9％；C組共觀察到原始卵泡286個(gè)，形態(tài)正常的原始卵泡比例為66.1％±11.1％，初級(jí)卵泡43個(gè)，形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例為59.0％±16.2％；D組共觀察到原始卵泡232個(gè)，形態(tài)正常的原始卵泡比例為48.4％±13.3％，初級(jí)卵泡58個(gè)，形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例為37.0％±14.0％。D組形態(tài)正常的原始卵泡比例明顯低于A、B、C組(t=4.12，P < 0.01)；A、B、C 3組中形態(tài)正常的原始卵泡比例無(wú)明顯差異(t=1.32，P >0.05)。D組中形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例低于A、B、C組(t=2.48，P < 0.05)；A、B、C 3組中形態(tài)正常的初級(jí)卵泡比例無(wú)明顯差異(t=1.69，P >0.05；圖1.A－D）。
2.2 電鏡檢查
相對(duì)于A組中形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)，B、C組中組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，僅見卵母細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞的細(xì)胞漿基質(zhì)電子密度稍下降，個(gè)別線粒體腫脹。D組中組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)存在一定程度的改變，主要見前顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的胞漿基質(zhì)電子密度下降，部分線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面核蛋白體稀疏，卵母細(xì)胞漿內(nèi)小空泡稍增多，個(gè)別前顆粒細(xì)胞膜可見微小的缺損，前顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的微絨毛分布相對(duì)稀疏（圖2.A－D）。
3 討 論
3.1 慢速冷凍和玻璃化冷凍對(duì)卵泡組織學(xué)形態(tài)的影響
張佳榮等[3]報(bào)道慢速冷凍和玻璃化冷凍對(duì)小鼠卵巢組織中原始卵泡形態(tài)的影響無(wú)明顯差異。但是本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)慢速冷凍對(duì)人類卵巢組織中原始卵泡和初級(jí)卵泡的形態(tài)影響較大，而玻璃化冷凍對(duì)原始卵泡和初級(jí)卵泡的形態(tài)影響與新鮮卵巢組織相比無(wú)明顯差異。Gandolfi等[4]報(bào)道玻璃化冷凍人類卵巢組織可以較好的保存原始卵泡和初級(jí)卵泡，Gook等[5]報(bào)道慢速冷凍人類卵巢組織對(duì)原始卵泡和初級(jí)卵泡的形態(tài)影響較大，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法，相對(duì)優(yōu)于慢速冷凍。可能是因?yàn)槁殉步M織中含有多種類型細(xì)胞，對(duì)緩慢降溫的速度、人工植冰時(shí)機(jī)等要求各不相同而且差異較大，使得慢速冷凍卵巢組織后較易形成冰晶，冷凍損傷較大。而玻璃化冷凍始終保持組織細(xì)胞溶液中水分子和離子的原始分布，減少甚至避免冰晶的形成，避免不同類型細(xì)胞所需的不同的冷凍平衡要求，使得卵巢組織中原始卵泡和初級(jí)卵泡均得到有效保存。
3.2 慢速冷凍和玻璃化冷凍對(duì)原始卵泡超微結(jié)構(gòu)的影響
本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍后組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。有學(xué)者報(bào)道小鼠卵巢組織玻璃化冷凍后原始卵泡的超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變[6]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。提示玻璃化冷凍后組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損傷。Oktay等[7]報(bào)道慢速冷凍保存人卵巢組織，組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損傷。但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢速冷凍后組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)中可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，微絨毛減少，卵母細(xì)胞漿內(nèi)小空泡增多以及個(gè)別的前顆粒細(xì)胞膜不完整，提示慢速冷凍后組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡超微結(jié)構(gòu)存在一定的損傷，但是對(duì)原始卵泡的發(fā)育潛能是否存在影響尚需進(jìn)一步研究。
3.3 不同的冷凍載物對(duì)玻璃化冷凍保存卵巢組織效果的影響
玻璃化冷凍的關(guān)鍵是如何使組織細(xì)胞較好的形成“玻璃化"狀態(tài)，盡量避免冰晶形成。目前主要是通過(guò)改良冷凍載物加快冷凍降溫速度來(lái)改善玻璃化冷凍效果。傳統(tǒng)的麥管玻璃化冷凍，冷凍降溫速度較慢，約1500 ℃/min。而采用尼龍網(wǎng)、銅格等冷凍載物使組織與液氮直接接觸，降溫速度達(dá)15 000 ℃/min。但是本實(shí)驗(yàn)中尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對(duì)人類卵巢組織中卵泡形態(tài)的影響無(wú)明顯差異。Isachenko等[8]報(bào)道用銅格為冷凍載物玻璃化冷凍和麥管玻璃化冷凍對(duì)人類卵巢組織中卵泡形態(tài)影響無(wú)明顯差異，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。可能的原因是卵巢組織片結(jié)構(gòu)較致密而且組織表面積與其容量之比相對(duì)較小，使得卵巢組織內(nèi)部冷熱交換的速度無(wú)明顯改善。因此，通過(guò)改良冷凍載物使卵巢組織表面與液氮直接接觸，可能并不能有效地改善玻璃化冷凍效果。尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍中卵巢組織與液氮直接接觸，可能會(huì)增加卵巢組織受病原體污染的機(jī)會(huì)。但是尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍，裝載卵巢組織片快速簡(jiǎn)便，每個(gè)尼龍網(wǎng)袋可以裝載較多的卵巢組織片，而麥管玻璃化冷凍操作較復(fù)雜，每根麥管僅能裝載1至2個(gè)卵巢組織片。因此，尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍可以在短時(shí)間內(nèi)完成大量卵巢組織片的冷凍保存，具有一定的*性。
總之，本研究結(jié)果提示玻璃化冷凍是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法。尼龍網(wǎng)玻璃化冷凍對(duì)玻璃化冷凍效果無(wú)明顯改善作用，但是操作更簡(jiǎn)便，較適宜大量卵巢組織的冷凍保存。
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